张秋萍、燕子/翻译

色谱学堂/校正

在“多维色谱在液相上有哪些新突破？ “中，我们给大家介绍了多维色谱在液相上的新突破和应用，

在最后，我们提到“目前在生物制药材料（会越来越复杂的一类材料）的分析上，应用二维液相色谱有了巨大进展。”

这一期，我们就来具体看看二维液相色谱在生物制药行业有哪些应用。

在癌症、炎症以及自身免疫性病症等疾病的治疗过程中，蛋白类生物药品是重要的一类药物。

蛋白药物有很多不同形式，目前应用最多的是

单克隆抗体 (monoclonalantibodies,mAbs) 和抗体偶联药物 (antibody−drugconjugates, ADC)。

这些蛋白质分子的明显优势在于他们的安全性和有效性，到现在临床研究中已经超过了2000种，

其中250种已经获准用于人类疾病治疗。

可以毫无疑问地说，生物制药的前景非常广阔。

如图1所示，蛋白质、单抗和抗体药物结合物是由生物体产生的。

复杂性远远超过化学合成所产生的小分子和肽。

在生物制药中，这种复杂性表现为微不均一性(microheterogeneity)，

在蛋白表达、纯化和长期储存(即糖基化、脱酰胺、氧化、硫化，聚集，等等)过程都会发生异质性，

这些小的修饰在一个非常大的分子上表征。

图2 蛋白质微不均一性

这种内在的复杂性可以用mAbs来很好地说明，它大约有150 kDa大小，1300个左右氨基酸和一些糖基化基团。

从理论上讲，mAbs由单一的蛋白产生，但实际由成千数百种异构形式组成，并且他们都是安全和有效的。

除mAbs以外，ADCs更为复杂，这是因为ADCs是将多种多样的细胞毒性药物结合到从原来就异质性的单克隆抗体上。

因此，ADC药物其药物加载量及其单抗上的分布通常为不均一的。

图4 ADC的结构

如图5所示，目前有许多关于mAbs和 ADCs的色谱分析方法。

图5  用于分析蛋白药物特征的色谱方法

一些非变性方法包括：离子-交换色谱法(IEX)，凝胶排阻色谱(SEC)和疏水色谱法(HIC)，

这些方法分别根据化合物电荷性质、分子大小、疏水性质来将其分离。

这些分析方法被生物化学家们广泛应用，但是由于流动相中高浓度的缓冲盐而不能用于质谱分析。

因此，一些替代质谱的分析方法，比如说反相色谱法(RPC)，亲水色谱法(HILIC)在蛋白药物的分析鉴定中更受欢迎。

在最近几年，上述分析方法都得到了极大的改进，用以满足非常复杂的生物制品的分析要求。

以下罗列出的色谱仪器和色谱柱的发展，也大大的增加了蛋白质组分的分离效率：

这些改进解释了为什么色谱分析方法优于长期以来分析蛋白质的电泳方法（凝胶或毛细管）。

然而，由于生物制品的内在复杂性，这些在色谱改进方面的努力尚不足以处理如此复杂的样品，

因为其中包含许多与之密切相关的异构体。

所以，在学术机构和生物制药行业，许多人尝试使用二维色谱技术来解决这种复杂性。

用二维液相色谱（2D-LC）有两种原因：

首先，可以从分离的两个维度获得关于蛋白质异构体的补充信息，并获得高分辨率；

其次，使非变性方法(IEX、SEC和HIC)与质谱检测器相结合，可以鉴定所观察到的色谱峰。

事实上，上述所有色谱技术(即IEX、SEC和HIC、RPC和HILIC)都可以组合。

在实际操作中，二维设置的第二个维度通常包括RPC(由于使用了挥发性流动相可直接与质谱兼容)，

有时还包括SEC(在不变性条件下，可能将盐和蛋白质从第一个维度分离)。

许多2D组合并结合质谱已经用于mAbs 和 ADCs的表征分析。

图6:用HIC×反相色谱分离ADC药物(brentuximabvedotin)。左图：HIC分离图；右图：二维图(HIC×反相色谱)

除了这些例子之外，还有许多其他的组合色谱法来设置二维色谱(2D-LC)对mAb和ADC样品进行表征。

随着一些新形式的单抗(如双特异性抗体bsAbs、抗体偶联双药ADDCs等)的复杂性不断增加，

并且需要在原研药和生物相似产品之间进行可比性研究，未来二维色谱(2D-LC)在生物制药方面的应用，前景一片光明。

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